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天天都在用標記抗體，但對抗體的標記方法，你了解多少呢？

更新時間：2022-05-20  |  點擊率：2059



關(guān)注Bioss公眾號的小伙伴都知道，Bioss在4月份與大家分享了直標一抗在科學研究領(lǐng)域應(yīng)用的優(yōu)勢及要點，那么問題來了，直標一抗都有哪些標記物呢？其常用的標記方法你了解嗎？

如此重要的問題，且聽Bioss小編慢慢道來......

抗體標記是指將標記物（酶、熒光染料、生物素、膠體金等）以共價結(jié)合或物理吸附的方式與抗體進行連接，形成抗體-標記物復(fù)合物；在抗體-標記物復(fù)合物與待檢物形成特異性多元復(fù)合物后，通過熒光顯微鏡、射線測量儀、酶標檢測儀、電子顯微鏡和發(fā)光免疫測定儀等精密儀器對試驗結(jié)果進行檢測，進而實現(xiàn)細胞、亞細胞、超微結(jié)構(gòu)等不同水平上對抗原、抗體反應(yīng)的定性及定位研究，或者應(yīng)用各種免疫分析方法對體液中的半抗原、抗原進行定性和定量測定。目前抗體標記技術(shù)己被廣泛用于醫(yī)學病理學、免疫組織化學、分子生物學、生物制藥等領(lǐng)域的分析研究與技術(shù)測定。下面簡要介紹幾種常見的抗體標記方法：


一、酶標記

以共價鍵結(jié)合的方式將酶聯(lián)結(jié)在抗體上，得到酶標抗體復(fù)合物，之后借助酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，這些有色產(chǎn)物可用肉眼、顯微鏡、分光光度計等進行觀察或測定，從而證明發(fā)生了相應(yīng)的免疫反應(yīng)。在生命科學的科學研究過程中，常用的抗體標記酶包含辣根過氧化物酶 (HRP)和堿性磷酸酶 (AP)。
1、辣根過氧化物酶標記
辣根過氧化物酶標記抗體一般采用過碘酸鈉法。過碘酸鈉法的原理是通過過碘酸鈉將HRP的糖基氧化成醛基，該醛基可與抗體IgG上的氨基進行結(jié)合，形成Schiff氏堿。
2、堿性磷酸酶標記
堿性磷酸酶標記抗體時常用的是戊二醛一步法。在標記時，先將堿性磷酸酶與單抗混合，之后加入適量的戊二醛，使堿性磷酸酶和抗體蛋白的氨基分別與兩個醛基結(jié)合，進而形成結(jié)合物。




二、熒光染料標記

熒光標記技術(shù)是指將能發(fā)射熒光的標記物通過共價結(jié)合或物理吸附等方式標記于目標分子的某個基團上，從而利用標記物的熒光特性來反映研究對象的信息。常見的熒光染料包含小分子熒光染料、時間分辨熒光材料、上轉(zhuǎn)化發(fā)光材料、量子點熒光材料等。

1、小分子熒光染料
目前，關(guān)于小分子熒光染料的報道中，常用到的熒光基團多為芳香族的化合物，在抗體標記過程中常用到的小分子染料包含以下幾類：
(1)熒光素類 (如FITC)：異硫氰酸熒光素 (FITC)是目前應(yīng)用較為廣泛的一種熒光素衍生物，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC標記抗體是基于FITC 的異硫氰基在堿性條件下能與IgG的自由氨基結(jié)合，進而形成IgG與熒光素的結(jié)合物。
(2)羅丹明類：是以氧雜蒽為母體的堿性呫噸染料，是生物醫(yī)學中常用的一類熒光染料，一般通過與被標記物的氨基結(jié)合實現(xiàn)標記。
(3)花菁類熒光染料 (如Cy系列染料)：菁染料在光照下不穩(wěn)定，但具有摩爾消光系數(shù)高、光譜范圍廣且光量子點產(chǎn)率高等特性，在使用時可通過染料的NHS與抗體的氨基連接，進而形成結(jié)合復(fù)合物。
(4)羅丹明或coumarin等染料的衍生物 (如Alexa Fluor)：Alexa Fluor通過利用磺酸或磺酸鹽代替羅丹明或coumarin等染料中的氫原子而合成，主要通過磺酸酯活性基團與生物分子中的伯胺相結(jié)合形成琥珀酰亞胺酯穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)、核酸等生物分子的 Alexa Fluor 熒光標記。
(5)其他染料，如吖啶、菲啶類、查爾酮和coumarin類、稠環(huán)芳烴類、噻嗪/噁嗪類、丹磺酞胺、卟啉類等。

部分常見熒光標記物的激發(fā)和發(fā)射波長

2、時間分辨熒光材料、上轉(zhuǎn)化發(fā)光材料、量子點熒光材料
相對于小分子熒光染料，時間分辨熒光材料、上轉(zhuǎn)化發(fā)光材料、量子點熒光材料是三種新型的熒光材料，其中，時間分辨熒光材料以鑭系元素, 如銪 (Eu)、鋱 (Tb)、釤 (Sm)等標記抗體, 利用時間分辨熒光儀特定的延遲一段時間測量，獲得鑭系元素的特異熒光信號；上轉(zhuǎn)化發(fā)光材料是在受到低能量的光激發(fā)情況下，發(fā)射出高能量的光，即經(jīng)波長長、頻率低的光激發(fā)，材料發(fā)射出波長短、頻率高的光；量子點 (quantum dots)是一類由Ⅱ－Ⅵ族或Ⅲ－Ⅴ族元素組成的能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的半導體納米顆粒，量子點熒光強度高且持續(xù)時間長，光化學性質(zhì)非常穩(wěn)定，不易發(fā)生光漂白，可經(jīng)受反復(fù)多次的激發(fā)，這為研究生物細胞內(nèi)分子之間的長時間作用提供了有力的工具。
在標記方法上，這三種熒光材料一般會利用表面羧基基團與抗體的氨基基團進行偶聯(lián)。



三、生物素標記

生物素標記反應(yīng)常用生物素琥珀酰亞胺酯進行。生物素是與抗體分子的游離賴氨酸等發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)而完成標記。一般一個抗體可以標記3-5個生物素，標記時，生物素與抗體的比率受抗體濃度影響，對于10 mg/ml 的抗體溶液來說，生物素應(yīng)超過蛋白12倍（摩爾數(shù)），對于2 mg/ml 的抗體溶液應(yīng)超過20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。




四、膠體金標記

膠體金標記是利用氯金酸在還原劑作用下聚合成直徑 1~150nm的金顆粒, 形成帶負電的疏水膠溶液。由于靜電作用成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài), 稱膠體金。

膠體金標記就是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。吸附機理是膠體金顆粒具有高電子高密度的特性, 其表面的負電荷能與蛋白質(zhì)的正電荷基團靜電吸附而牢固結(jié)合。

不同免疫檢測實驗中經(jīng)常用到的標記物類型匯總